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實時熒光定量PCR結果分析,教你從菜鳥到高手
發布者:百代生物  來源:  發布時間:2017-11-23

實時熒光定量PCR技術(Real-Time Quantitative PCR)是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

在對熒光定量PCR結果進行分析時首先要了解幾個概念:


基線(Baseline)指在PCR擴增反應的最初數個循環里,熒光信號變化不大,接近一條直線,這樣的直線即基線。


光域值threshold的設定,一般將PCR反應前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號,熒光域值是PCR3-15個循環熒光信號標準差的10倍,熒光域值設定在PCR擴增的指數期。


CT值表示每個PCR反應管內熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。研究表明,各模板的CT值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系,起始拷貝數越多,CT值越小,反之亦然。


融解曲線是用來驗證擴增產物特異性的,如果產物是單一條帶,融解曲線就會出現一尖峰;如果有引物二聚體或其它非特異性擴增,就會出現至少兩個尖峰。


Real-Time qPCR 常見問題分析


1.無Ct值出現


1)檢測熒光信號的步驟有誤:一般SG法采用72℃延伸時采集,Taqman法


則一般在退火結束時或延伸結束采集信號;


2)引物或探針降解:可通過PAGE電泳檢測其完整性;


3)模板量不足:對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;


4)模板降解:避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況。


2.Ct 值出現過晚(Ct>38)


1)擴增效率低:反應條件不夠優化,設計更好的引物或探針、改用三步法 進行反應、適當降低退火溫度、增加鎂離子濃度等;


2)PCR各種反應成分的降解或加樣量不足,


3)PCR產物太長:一般采用80-150bp的產物長度。


3.標準曲線線性關系不佳


1)加樣存在誤差:使得標準品不呈梯度;


2)標準品出現降解:應避免標準品反復凍融,或重新制備并稀釋標準品;


3)引物或探針不佳:重新設計更好的引物和探針;


4)模板中存在抑制物,或模板濃度過高。


4.負對照有信號、溶解曲線不止一個主峰


1)引物設計不夠優化:應避免引物二聚體和發夾結構的出現;


2)引物濃度不佳:適當降低引物的濃度,并注意上下游引物的濃度配比;


3)鎂離子濃度過高:適當降低鎂離子濃度,或選擇更合適的mix 試劑盒;


4)模板有基因組的污染:RNA提取過程中避免基因組DNA 的引入,或通過引物設計避免非特異擴增。


5.擴增效率低


1)反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解;


2)反應條件不夠優化:可適當降低退火溫度或改為三步擴增法;


3)反應體系中有PCR反應抑制物:一般是加入模板時所引入,應先把模板


適度稀釋,再加入反應體系中,減少抑制物的影響。


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