“Bioline,siRNA轉染試劑,假病毒包裝,熒光定量PCR試劑,唾液DNA提取試劑”/

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熒光PCR/實時定量PCR技術應用簡介
發布者:百代生物  來源:  發布時間:2017-11-27

一.熒光PCR原理 

1.熒光共振能量傳遞 (FRET)

某熒光標記基團在激發光刺激下生成某波長的發射光,當另一屏蔽基團與其距離合適時,原發射光將會被屏蔽基團所吸收,并轉化為其他波長的發射光或熱能,稱之為FRET。

          

2.熒光化學:

熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為兩種:熒光探針和熒光染料。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時,報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監測系統可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。

二.實時熒光PCR技術靶基因的確定及引物和探針的設計原則

1.靶基因的確定:選擇檢測組共有的基因以避免檢測的假陰性(漏檢)。

2.檢測片段的確定:選擇檢測組內的保守 (突變少)(避免假陰性)、組間特異的序列 (突變多)(避免假陽性)作為引物探針的設計位置。片段長度70-150bp。

3.引物:長度17-25bp;GC含量30-80%;退火溫度(Tm值)58-60℃;避免穩定的引物二聚體(特別是多聯檢測)及發夾結構(自由能大于-3.5kc/m);序列不能出現連續的G,3’端避免G或C,最后5個堿基內避免兩個以上的G或C。

4.探針:長度20-30bp(Taqman)或16-25bp(MGB);GC含量30-80%;Tm值為68-70℃;避免穩定的二聚體及發夾結構 (自由能大于-3.5kc/m);5’端不能是G;位置盡量靠近上游引物;選擇波長差異較大(多聯檢測)或Fam(單聯檢測)的熒光標記。

三.特點和優勢

1.特異性強:引物和探針的“雙保險”,避免檢測的假陽性。

2.靈敏度高:分析PCR產物的對數期,自動化儀器收集熒光信號,避免了許多人為因素干擾。

3.避免污染:全封閉反應,無須PCR后處理。

4.實現定量:運用標準品獲得標準曲線,結合Ct值進行準確定量。

5.高效低耗:可實現一管多檢。

6.操作簡便:在線式實時監測擴增結果,不必接觸有害物質。

7.快速:反應時間<1.5小時。

四.實用意義:

1.提高檢測效率,縮短檢測周期,提高通關速度;

2.降低檢測成本,提高經濟與社會效益。


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