“Bioline,siRNA轉染試劑,假病毒包裝,熒光定量PCR試劑,唾液DNA提取試劑”/

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談談實時熒光定量PCR之絕對定量分析
發布者:百代生物  來源:  發布時間:2017-11-28

在科研工作中,我們常常想通過PCR的方法確定未知樣本中目標基因的絕對含量,如檢測乙肝病人的每毫升血液中HBV DNA的精確拷貝數,這時我們就用到了實時熒光定量中的絕對定律分析。

            


絕對定量是用已知濃度的標準品繪制標準曲線來推算未知樣品的量。將標準品稀釋至不同濃度,作為模板進行PCR反應。以標準品拷貝數的對數值為橫坐標,以測得的CT值為縱坐標,繪制標準曲線,對未知樣品進行定量時,根據未知樣品的CT值,即可在標準曲線中得到樣品的拷貝數。


1.絕對定量標準品的制備方法


將待測序列裝入已知大小的質粒中作為標準品。ND-1000型微量紫外分光光度儀測質粒濃度,按以下公式計算質??截悢担?/p>

質??截悢? copies ?μ L -1)=6.02 ×1023 ( copies ? mol-1)×質粒濃度( g ?μL-1) /質粒分子量( g ? mol -1)

將質粒用ddH2O進行10倍倍比稀釋,待測品與標準品加在同一塊96孔板,使用與標準質粒相同的反應條件和相同的引物序列進行熒光定量PCR。以標準品拷貝數的對數值為橫坐標,以CT值為縱坐標建立標準曲線。(X:Ct 值,Y:起始模板對數值)(見Fig.1)


2.倍比梯度稀釋方法:


1v原液(標準品i)+9v稀釋緩沖液,得標準品ii

1v標準品ii+9v稀釋緩沖液,得標準品iii

1v標準品iii+9v稀釋緩沖液,得標準品iv

1v標準品iv+9v稀釋緩沖液,得標準品v

依次倍比稀釋


3.目的基因絕對值的計算


根據待測樣本的CT值,即可在標準曲線中計算出熒光信號達到閾值時擴增產物的量,然后根據公式LogYCt=LogX+Ct×Log(1+E)計算原始模板的拷貝數。

X:原始模板的拷貝數;E:擴增效率;YCt:熒光信號達到閾值時擴增產物的量


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