“Bioline,siRNA轉染試劑,假病毒包裝,熒光定量PCR試劑,唾液DNA提取試劑”/

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手把手教你做細胞轉染
發布者:百代生物  來源:  發布時間:2017-12-5

經典的轉染技術最初用于將質粒DNA導入細胞中,而質粒DNA仍是目前最常用的轉染載體。含有重組基因和調控元件的DNA質??梢赞D染至細胞內,用于研究基因功能和調控、基因產物突變分析和生物化學特性、基因表達對細胞健康和周期的作用以及蛋白質的大規模生產 (用于純化和下游應用)。載體的拓撲結構(線性或超螺旋)和大小、質粒DNA的質量及啟動子選擇是影響質粒DNA轉染效率的主要因素。


             


1.載體考慮因素

做轉染時到底選擇環狀DNA還是線性DNA呢?且看下文:

采用高度超螺旋DNA進行瞬時轉染的效率高于線性DNA,這可能是由于環狀DNA對外切酶的敏感性不高,而線性DNA片段則可以在這些酶的作用下快速降解此外,原子力顯微鏡分析顯示,陽離子脂質體試劑與環狀和線性DNA可以形成極為不同的復合結構:環狀DNA可以觀察到緊密的球形或柱形結構,而線性質粒則呈珠鏈樣結構。

盡管陽離子脂質體介導的環狀質粒轉染可能是通過內吞作用進入細胞,但線性DNA結構的進入通路與之差異明顯且效率較低。

線性DNA可以最佳整合至宿主基因組,因此使用線性DNA進行穩定轉染的效率更高。盡管具有自由端的線性DNA被細胞攝取的效率較低,但更容易發生重組,整合至宿主染色體生成穩定轉化體的可能性更高。在陽離子脂質體介導的轉染中,盡管細胞攝取效率相當,但較大質粒的核輸送效率低于較小的質粒分子。使用質量或摩爾濃度相等的不同大小的載體可以觀察到上述現象,說明質粒的核輸送可能會受到細胞內運輸速率的限制,較小的質??梢钥焖偻ㄟ^細胞質,躲避降解作用和細胞防御機制。

 

2.質粒DNA的質量

質粒DNA的純度和質量是轉染成功的關鍵。

使用最高純度的質粒DNA (不含苯、氯化鈉和內毒素)可以獲得最佳的結果。污染物會殺死細胞,而鹽會干擾脂質體復合物的形成,從而降低轉染效率。

內毒素,也被稱做脂多糖(LPS),是格蘭氏陰性菌(比如大腸桿菌)細胞膜的成分。它通常在質粒制備的裂解步驟中釋放出來,并且與質粒DNA共純 化。與質粒DNA共存的內毒素會導致轉染效率顯著下降,特別是對于原代細胞和敏感性的細胞系而言。如果要轉染內毒素敏感的細胞(比如原代細胞、懸浮細胞和 造血細胞),或者想要獲得最高的轉染效率和最低的細胞毒性,我們推薦使用一些商業化的試劑盒來純化DNA——這些試劑盒是經過專門的設計,能去除內毒素, 保證得到最佳的轉染結果。

DNA-脂質體復合物或DNA溶液過度渦旋振蕩會導致剪切作用,尤其是較大的分子,從而降低了轉染效率。稀釋DNA中的EDTA濃度不得超過0 3 mM。


3.基因產物和啟動子質粒

啟動子的選擇取決于宿主細胞系、需要表達的蛋白質和期望的表達水平。許多研究人員使用強啟動子CMV (巨細胞病毒),它可以在各種細胞類型中提供最高的表達活性。另一個用于哺乳動物細胞的高水平蛋白質表達的強啟動子是EF-1α (人類延伸因子-1α)。但是,使用過強的啟動子促進具有潛在毒性的基因的表達,會在質粒DNA的瞬時轉染中引起一定的問題。

建議使用弱啟動子轉染具有潛在毒性的基因產物。毒性基因產物也是穩定轉染細胞篩選的問題之一。當抗生素抗性基因表達危害轉染細胞的健康時,表達該基因的細胞會喪失生長優勢,從而無法獲得穩定轉染的克隆(組成型啟動子)。此時,可以使用誘導型啟動子控制基因表達的時序,從而實現穩定轉染子的篩選。誘導型啟動子一般需要誘導物分子(如金屬離子、代謝產物或激素)存在方可發揮功能,但一些誘導型啟動子可以以相反的方式發揮功能,即在無特定分子存在的情況下誘導基因表達。

細胞類型特異性的啟動子也很常用,如用于昆蟲細胞表達的多角體蛋白啟動子。文獻搜索是確定哪種啟動子最適合您的細胞系或應用的最佳工具。











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