“Bioline,siRNA轉染試劑,假病毒包裝,熒光定量PCR試劑,唾液DNA提取試劑”/

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轉染效率不高?百代來幫忙!
發布者:百代生物  來源:  發布時間:2017-12-6

細胞轉染技術是采用一定的方法和途徑將外源核酸分子如 DNA、RNA 等導入特定的細胞并表達目的基因,產生特定功能的蛋白質分子。


首先,不同種類的細胞本身在轉染效率上的差距就很大,比如貼壁細胞和懸浮細胞之間轉染差距就很顯著,天生趨于懸浮的細胞就難以轉染。因為這兩種不同狀態的細胞漿膜結構不一樣,可能導致了某些細胞類型天生的難以轉染,所以尋找高效的轉染試劑應對這類型細胞就顯得尤為重要。


細胞在不同分裂期,攝取并表達外源 DNA 的能力也有顯著性差異。因此選擇合適的培養狀態的細胞對轉染也有著不小的影響,此外還常用一些促有絲分裂刺激物(條件培養基,生長因子,滋養細胞)來活化原代培養細胞。


細胞在凍存復蘇后一到兩代或直到它們完全復蘇之前都是很難轉染的,但是傳代次數過多,對于轉染而言,在不同細胞系中表現出來的差異也很大。有些細胞系傳代很多次還能夠保證很高的轉染效率,而其他一些細胞系則傳代很少次數轉染效率就有顯著差異。


因為有些細胞系是不穩定的,可能隨著培養時間的改變,培養條件的不同,不同的選擇壓力,可能引起不同的克隆選擇。因此就算是同一個細胞系,在不同條件下轉染能力的差異可能會很大。



首先要保證所轉染核酸的正確性和完整性,超螺旋結構和舒展結構之間比例、雙螺旋中斷、核酸酶的降解,以及來自于儲存和處理過程中的物理壓力和污染物(如內毒素等)都會影響到轉染效率。


其次是載體構造,如啟動子、增強子、Ori 等。轉染體系中一般都帶有強病毒調節元件 (如 RSV、CMV 和 SV40)的對照載體進行優化和比較。然而,病毒啟動子、增強子體系的相對有效性在不同細胞系間的差異可大到兩個數量級。例如,在某些細胞系中,由于自發的質粒擴增,SV40 體系可高效表達 large T 抗原 (如,COS);而在其他許多細胞系中,則是 CMV 啟動子更為有效。除此之外,各種 CMV 載體的表達率也會有超過一個數量級的差異,這部分是由于載體中其他調節元件所引起的。所以選擇適當的載體結構,對轉染成功起到非常重要的作用。


轉染試劑/DNA配比,離子強度,pH值等因素都有可能影響到轉染效率。應該注意的是,一般情況下要求在不含血清或者其他蛋白的培養基中制備轉染復合物,因為它們會對轉染產生抑制效果。


制備轉染復合物的最佳孵育時間,不同轉染試劑之間的差別非常巨大,但是這是非常關鍵的一個環節,直接影響到轉染復合物制備的質量,所以應該嚴格按照說明書上的孵育時間進行。


導致實驗失敗的還有很大一部分原因是因為污染問題,包括 DNA污染,細菌、真菌、病毒、支原體等微生物污染,和不同實驗之前的不同細胞的交叉污染。養成良好的實驗習慣,時刻注意污染源存在,謹防實驗材料和污染源接觸,建立嚴格的細胞系鑒定標準,才能盡可能的杜絕污染問題導致的實驗損失。











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