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百代生物教您輕松翻越細胞轉染的八大坑
發布者:百代生物  來源:  發布時間:2017-12-11

細胞轉染是實驗中常見的實驗手段,從基因表達到RNA干擾,再到如今大熱的基因組編輯,他們都離不開細胞轉染這個前提。問題是,細胞并不想接收它們,而細胞膜也是一個可怕的屏障,因此科研工作者們往往面臨轉染效果不好或者細胞死亡等嚴重問題,尤其是針對原代細胞的轉染難度更大。本文總結了細胞轉染效率低下的八大坑,并教您如何輕松翻越這些坑,招招干貨!

                  



1.準備不足

做轉染的時候,在開展正式實驗前要多做預試驗,優化轉染條件。優化轉染條件包括:轉染試劑的用量、DNA密度、細胞密度、孵育時間等等。


2.細胞狀態不好

細胞狀態不好,會導致轉染效率低下。一般進行轉染的細胞應該處于對數生長期。如果是貼壁細胞的話,貼壁率應該在70-80%;如果是懸浮細胞的話,應該是6X105個/孔(24孔板),一般是轉染前一天換液,轉染前用無血清培養基或PBS洗細胞一次。轉染的整個過程都不應該有抗生素。


3.試劑過期

過期轉染試劑會大大降低轉染效率,千萬不要為了省錢,影響實驗進度。


4.未加血清

傳統脂質體轉染后未及時加入血清,會導致細胞大量死亡。一般要在轉染后的4-6小時換液且換為有血清的培養基。


5.細胞污染

細胞污染也是造成細胞死亡,轉染效率低下的一大原因。首先,轉染細胞用的質粒必須保證無菌。而現在市場上的一般的質粒提取試劑盒都做不到絕對無菌。這里再貢獻一個獨門絕招:將提完質粒后或者提的最后一步,用75%乙醇沉淀,這樣就除菌了。


6.質粒不達標

轉染用的質粒首先要保證數量,一般為2 μg以上。質粒純度不夠或者含有細菌LPS或其他對細胞有毒害作用的物質(內毒素),也會影響轉染效率。

(推薦使用QIAGEN的無內毒素質粒提取試劑盒:Qiagen EndoFree Plasmid Kit可以純化得到至多10mg無內毒素高轉染級純質粒,純化得到的DNA內毒素水平低于0.1EU/ug)。


7.不注意細節

在轉染之前更換一次37℃預溫的培養基,可提高轉染效率。轉染試劑和DNA/RNA混合物應當一滴一滴地滴下來,從培養皿一邊滴到另一邊,邊滴邊輕搖培養皿,以確保均勻分布和避免局部高濃度。這些都是一些細枝末節,但是,如果不注意的話,也會造成轉染效率低下。



8.轉染試劑選擇不匹配

轉染試劑跟細胞系也是講究配合默契的,使用同一種試劑,不同細胞系轉染效率通常不同。如果選擇了一款毒性比較大的轉染試劑,而自己養的細胞有特別容易死亡的話,那就要換轉染試劑了。選一款適合自己試驗的轉染試劑是試驗成功的關鍵因素之一。


細胞轉染是個細活,希望廣大業內人士學習了以上經驗之后能夠輕松翻越轉染過程中的這些坑,早日出成果!





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